如何使用光学显微镜
一、显微镜的光学系统
显微镜的光学系统主要包括物镜、目镜、反射镜和聚光镜四个部分。广义来说，还包括光源、滤光片、盖玻片、载玻片。
(1)物镜
物镜是决定显微镜性能的最重要的部件。它安装在物镜转换器上，靠近被观察物体，故称物镜或物镜。
1，物镜的分类
物镜根据使用条件不同可分为干式物镜和浸没式物镜；其中浸没式物镜又可分为浸没式物镜和油浸式物镜(常见的放大倍数为90-100倍)。
根据放大倍数的不同，可分为低倍物镜(10倍以下)、中倍物镜(20倍左右)和高倍物镜(40-65倍)。
按像差校正可分为消色差物镜(常用，可校正光谱中两种颜色的色差)和复消色差物镜(可校正光谱中三种颜色的色差，价格昂贵，很少使用)。
2.物镜的主要参数:
物镜的主要参数包括放大率、数值孔径和工作距离。
①放大率是指眼睛看到的图像的大小与对应标本的大小之比。它指的是长度之比，而不是面积之比。例:放大倍数为100×，指长度为1 μ m的标本，放大图像的长度为100 μ m，如果按面积计算，放大倍数为10000倍。
显微镜的总放大率等于物镜和目镜的放大率的乘积。
②数值孔径，也叫孔径比，缩写为NA或A，是物镜和聚光镜的主要参数，与显微镜的分辨率成正比。干式物镜的数值孔径为0.05-0.95，油浸式物镜(香沥青)的数值孔径为1.25。
③工作距离是指观察标本最清晰时，物镜前透镜下方到标本盖玻片上方的距离。物镜的工作距离与物镜的焦距有关。物镜焦距越长，放大倍数越低，工作距离越长。例:物镜上标注10/0.25和160/0.17，其中10为物镜的放大倍数；0.25是数值孔径；160为镜筒长度(mm)；0.17是盖玻片的标准厚度(单位:毫米)。10x物镜有效工作距离6.5mm，40x物镜有效工作距离0.48mm。
3.物镜首次用于放大标本。决定显微镜性能的最重要的因素是分辨率。
分辨率也称为分辨率或分辨力。分辨率由分辨率距离(两个物体之间可分辨的最小距离)的值来表示。在表观距离(25cm)上，正常人眼可以看到两个距离为0.073mm的物体，这个0.073mm的数值就是正常人眼的分辨距离。显微镜的分辨距离越小，分辨率越高，意味着性能越好。
显微镜的分辨率由物镜的分辨率决定，物镜的分辨率由其数值孔径和照明光的波长决定。
使用普通中心照明法(使光线均匀穿过标本的明亮照明法)时，显微镜的分辨距离为d=0.61λ/NA。
其中d是物镜的分辨距离，单位为nm。
λ ——照明光的波长，单位为纳米(nm)。
物镜的数值孔径
比如油浸物镜的数值孔径是1.25，可见光的波长范围是400-700 nm。如果平均波长为550 nm，d=270 nm，约为照明光波长的一半。通常，由可见光照明的显微镜的分辨率极限是0.2微米..
(2)、目镜
因为它靠近观察者的眼睛，所以也被称为目镜。安装在镜筒的上端。
1，目镜的结构
通常，目镜由两组透镜组成，上面的透镜称为物镜，下面的透镜称为会聚透镜或场透镜。上下镜片之间或场镜下方有光阑(其大小决定视野大小)。因为标本只是在光阑表面成像，所以可以在这个光阑上粘上一小段头发作为指针，指示某个特征的目标。目镜测微计也可以放在上面，用来测量被观察标本的大小。
目镜的长度越短，放大倍数越大(因为目镜的放大倍数与目镜的焦距成反比)。
2、目镜的作用
是将已经被物镜放大的清晰实像进一步放大，使人眼容易清晰分辨。
普通目镜的放大倍数为5-16倍。
3.目镜和物镜的关系
已经被物镜清晰分辨出来的微细结构，如果不被目镜放大，就看不清楚，达不到人眼可以分辨的大小；而物镜分辨不了的细微结构，虽然用高倍目镜放大了也看不清楚，所以目镜只能起到放大的作用，不会提高显微镜的分辨率。有时候，虽然物镜可以分辨两个接近的物体，但还是看不清楚，因为这两个物体的像距小于眼睛的分辨距离。因此，目镜和物镜是相互联系、相互制约的。
(3)、冷凝器
冷凝器也称为冷凝器。在样品下方的冷凝器支架上。它主要由聚光镜和光圈组成。其中聚光镜可分为明视场聚光镜(普通显微镜配置)和暗场聚光镜。
1，光学反射镜的主要参数
数值孔径(NA)是聚光器的主要参数。最大数值孔径一般为1.2-1.4，数值孔径有一定的可变范围。通常，刻在上镜头架上的数字代表最大数值孔径。通过调节下可变光阑的开度，可以获得低于这个数的各种数值孔径，以满足不同物镜的需要。有些聚光透镜是由几组透镜组成的，最上面的一组透镜可以去掉或移出光路，使聚光透镜的数值孔径变小，以适应低倍物镜观察时的照度。
2、冷凝器的作用
聚光镜相当于一个凸透镜，它汇聚光线以增强对标本的照明。一般来说，聚光器的聚焦焦点设计在其上端的透镜平面上方约65438±0.25毫米处。(对焦点在待观察标本上，载玻片厚度约为1.1mm)。
3.可变光圈
光圈也叫光圈，位于聚光器下方，由十几块金属片组成，中间有一个圆孔。它的作用是调节光强，使聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径相适应。光圈越大，数值孔径越大(观察结束后，光圈要调到最大)。
在虹膜下面，还有一个圆形的滤镜支架。
注:中学实验室只有教师用显微镜(1600×或1500×)配有聚光镜，学生用显微镜(640×或500×)配有旋转光阑。靠近舞台，可以做圆周旋转的圆盘，旋转光阑(又称快门)，光阑上有大小不同的圆孔，称为光圈。直径分别为2、3、6、12和16毫米。转动旋转光阑，光阑上的每个光圈都可以对准光圈，通过不同大小的光圈来调节光线的强弱。
(4)反射器
反射镜是一面可以随意旋转的双面镜，直径50mm，一面是平的，一面是凹的，作用是反射从任意方向通过通光孔射来的光。平面镜反光能力弱，所以光线强的时候用，凹面镜反光能力强，所以光线弱的时候用。
反射镜通常是一边是平面镜，另一边是凹面镜，安装在聚光器下面，可以在水平和垂直两个方向自由旋转。
反射镜的作用是使光源发出的光或自然光射向聚光器。用聚光镜的时候一般用平面镜，不用的时候用凹面镜；光线强的时候用平面镜，弱的时候用凹面镜。
观察结束后，反射镜应垂直放置。
(5)照明光源
显微镜可以用自然光源或人工光源照明。
1，自然光源
光线来自天空，最好是被白云反射。不要使用阳光直射。
2.人造光源
①对人工光源的基本要求:足够的发光强度；光源不能产生太多的热量。
②常见人工光源:显微镜灯；荧光
(6)滤光器
安装在光源和聚光器之间。作用是让选定波段的光通过并吸收其他光，即改变光的光谱组成或减弱光的强度。分为两类:光学滤镜和液体滤镜。
(7)盖玻片和载玻片
盖玻片和载玻片的表面应非常平整，没有气泡和划痕。最好选择无色透明的，使用前要洗净。
盖玻片的标准厚度为0.17±0.02mm，如果不使用盖玻片或盖玻片厚度不合适，会影响成像质量。
滑道的标准厚度是1.1.04 mm，一般可用范围是1-1.2 mm，太厚会影响聚光器的效率，太薄容易坏。
二、显微镜的机械装置
显微镜的机械装置是显微镜的重要组成部分。它的功能是固定和调整光学镜头，固定和移动标本等。它主要由镜头架、镜头臂、载物台、镜筒、物镜转换器和调焦装置组成。
(1)、镜座和镜臂
1，镜座的作用是支撑整个显微镜，配有镜子，有的还配有照明光源。
2.镜臂的作用是支撑镜筒和载物台。有固定式和可倾斜式两种。
②、舞台(又称工作台、镜面舞台)
载物台用于放置载玻片，有圆形和方形两种形状，其中方形面积为120mm×110mm。中央有一个灯孔，灯孔后面左右两侧有两个安装平板夹的小孔。有两种:固定式和移动式。有的载物台在纵横坐标上配有游标，一般读数为0.1 mm，游标可以用来测量试件的尺寸，标记被检部位。
(3)、镜筒
镜筒上端放置目镜，下端连接物镜转换器。有两种类型:固定式和可调式。机械镜筒长度(目镜筒上缘到物镜转换器螺丝口下端的距离称为镜筒长度或机械镜筒长度)称为固定镜筒，可调镜筒可以更换。大多数新型显微镜使用固定镜筒，大多数国产显微镜也使用固定镜筒。国产显微镜的机械镜筒长度通常为160 mm。
安装目镜的镜筒有两种:单筒和双筒。单缸可分为立式和倾斜式，双缸为倾斜式。其中双目显微镜可以双眼同时观察，减少眼睛疲劳。两个镜筒之间的距离可以调节，其中一个目镜有屈光度调节装置，方便不同视力的观察者。
(4)、物镜转换器
物镜转换器固定在镜筒的下端，具有3-4个物镜螺旋口。物镜应该按照放大倍数的顺序排列。旋转物镜转换器时，应该用手指握住旋转盘并旋转。不要用手指推物镜，因为长时间推容易使光轴歪斜，成像质量变差。
(5)、调焦装置
显微镜配有一个粗准焦螺丝和一个细准焦螺丝。有的显微镜粗准焦螺旋装在同一轴上，大螺旋是粗准焦螺旋，小螺旋是细准焦螺旋；其他单独安排。位于镜臂上端较大的一对螺丝为粗准焦螺丝，镜筒每旋转一周上升或下降10mm。位于粗准聚焦螺钉下方的一对较小的螺钉是细准聚焦螺钉。当它旋转一周时，镜筒的提升值为0.65438±0.0毫米，精准焦螺丝的调焦范围不小于65438±0.8毫米..
三、显微镜及其部件的使用
1.使用单筒显微镜时，要养成用左眼观察的习惯(因为平时都是用右手画画)。观察的时候，眼睛要同时睁开，不要合上一只，因为容易疲劳。为了训练学生习惯同时睁眼，可以剪一张长约14cm，宽约6cm的长方形硬纸，在靠近左端的镜筒上端挖一个直径略小于其外径的圆孔，将圆孔放在镜筒上段，观察时双眼同时睁开，用纸的右端挡住右眼的视线。经过一段时间的训练，我们可以习惯同时睁开双眼，然后把纸拿开。
2.直管显微镜的镜臂与镜座的连接处是一个机械接头，可以用来调节镜筒的倾斜度，便于观察。镜头臂不能向后倾斜太多，一般不超过40°。但在使用临时装载观察时(镜筒倾斜时，载物台随之倾斜，载物片上的液体容易流出)，禁止使用倾斜接头，尤其是装载含有酸性试剂时，以免玷污镜体。
3、目镜和物镜的使用
一般用中等放大倍数(10×)的目镜和最低放大倍数的物镜开始观察，逐渐用更高放大倍数的物镜寻找符合实验要求的放大倍数。
更换物镜时，先用低倍镜头观察，调整到正确的工作距离(成像最清晰)。如果进一步使用高倍物镜进行观察，则在更换高倍物镜之前，需要放大观察的物像部分应移动到视场中心(当将低倍物镜更换为高倍物镜进行观察时，视场内的物像范围缩小很多)。低倍物镜和高倍物镜基本对焦(聚焦在同一高度)。用低倍物镜观察清晰时，更换高倍物镜可以看到物像，但物像不一定清晰，可以转动微调焦螺丝来调节。
一般来说，使用任何物镜时，有效放大倍数的上限为1，000倍其数值孔径，下限为250倍其数值孔径。如果40×物镜的数值孔径为0.65，则上限和下限分别为1000×0.65=650倍和250×0.65≈163倍，超过有效放大倍数上限的称为无效放大倍数，不能提高观察效果。下限以下的放大倍数人眼无法分辨，不利于观察。通常，最实用的放大范围是数值孔径之间的数的500-700倍。
4、油浸物镜的使用
使用油浸式物镜时，一般不使用同高聚焦。同高对焦只适用于每台显微镜的原物镜，这在使用低倍和高倍物镜时是非常有利和方便的条件，但在使用油浸式物镜时则受到限制。一般来说，用油镜观察无盖玻片的标本(载玻片)时，聚焦在同一高度比较安全，但对于有盖玻片的标本要谨慎使用，因为油浸物镜的工作距离很短。
当物镜浸在油中时，只有芳香的焦油滴在标本上。观测结束后，应及时做好清洁工作。如果不及时做，香焦油会粘上灰尘，擦拭时灰尘颗粒可能会磨损镜片。香焦油长时间暴露在空气中，会变得又厚又干，非常难擦，对仪器非常不利。小心轻擦。用干镜面纸擦拭油浸物镜前端一两次，去除大部分油污，然后用二甲苯滴湿镜面纸擦拭两次，最后再用干镜面纸擦拭一遍。标本上的香沥青可以用“拉纸法”擦掉(即在香沥青上覆盖一小块擦镜纸，然后在纸上滴一些二甲苯，边湿边把纸拉出来，这样可以连续擦三四次，一般不会损坏没有盖玻片的涂片标本)。镜面清洁纸也要防尘。一般在使用前，将每页切成8小块，存放在干净的培养皿中，既经济又方便使用。
5.如何使用冷凝器
(1)、使用冷凝器的原因
当放大倍数增加时，一方面放大倍数越高，镜片越多，镜片吸收的光越多；另一方面，视场的亮度(指能看到标本的范围)与放大率的平方成反比，即放大率越高，视场越暗。为了获得足够的亮度，必须安装一个聚光镜，将光线聚集在要观察的标本上。
(2)、观察冷凝器的高度时应。
观察时，为保证最佳观察效果，聚光镜的聚焦焦点应刚好落在标本上。为了达到这一条件，有必要调整聚光器的高度。当用平行光照射时，聚光镜的焦点大约在其上透镜平面中心上方65438±0.25毫米处。因此，在观察时经常需要将聚光镜升高到其透镜上平面仅略低于载物台平面的高度，这样焦点就可能落在标准厚度载玻片上的标本上。使用比标准厚度薄的载玻片盛放标本时，聚光镜的位置要相应降低，而使用厚度过厚的载玻片时，聚焦点只能落在标本下方，不利于仔细观察。
③聚光镜和物镜的配合
这里所谓的配合，就是让聚光镜和物镜的数值孔径一致，从而进行更好更细致的观察。如果聚光器的数值孔径低于物镜的数值孔径，则物镜的部分数值孔径被浪费，从而不能实现其最高分辨率。如果聚光镜的数值孔径大于物镜的数值孔径，一方面不能提高物镜的规定分辨率，另一方面会因照明光束过宽而降低物像的清晰度。聚光镜与物镜匹配的操作方法是:照明对焦后，取下目镜直视镜筒，将聚光镜下的光圈关闭到最小，然后慢慢打开。打开到与视场直径相同的口径，然后按下目镜观察。每次更换物镜时，都要依次进行匹配操作。有些聚光镜光圈的边框上刻有表示开口光圈的刻度，可以根据刻度进行搭配。
显微镜的发明以及历史上显微镜的每一次革新，都给人类的认知带来了巨大的进步。它给人类生活带来了前所未有的扩展。在科技创新推动的今天，显微镜的使用已经成为中学生的一项基本技能，掌握结构，科学使用，维护好，使之成为青少年探索未来世界的窗口。